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徐廷弼︱基于基因测序技术对辣椒酱生产设备和

发布日期:2019-07-23 11:40 作者:澳门千亿 点击:

  (江南大学 生物工程学院,工业生物手艺训导部核心实习室,江苏 无锡,214122)

  摘要为进一步阐明辣椒酱中产气细菌的来历和引入阶段,采用古代作育基作育设施和16S rDNA测序设施对存正在产气局面的辣椒酱坐褥修设和气氛中的细菌菌群品种和含量举行了剖释。结果从辣椒酱坐褥修设和车间气氛平散开到6种好氧细菌和16种厌氧细菌。正在原料栈房、炒制间和包装间气氛中好氧细菌菌群密度分辩为3.0×102、1.3×104、8.2×102CFU/m3,而厌氧细菌菌群密度分辩为1.4×103、3.4×103、7.0×101CFU/m3;修设中好氧菌菌群密度分辩为:1.4×105、7.6×105、3.6×107CFU/g,而厌氧细菌菌群密度分辩为2.1×105、8.7×105、7.4×107CFU/g。修设中好氧菌群密度为:始末16S rDNA 测序判断,芽孢杆菌属细菌正在各工段中均占昭彰上风。正在3个坐褥工段好氧细菌中产芽孢菌占比分辩为52.31%、80.23%、100.00%,而正在厌氧细菌中产芽孢菌占比分辩为28.69%、80.23%、65.00%。归纳细菌品种和总数,结论为古代加热灭菌无法有用杀灭产芽孢菌,同时包装线具有二次污染隐患。

  辣椒酱是我邦古代食物,具有养分丰裕、色泽美丽、增长食欲等特性,深受消费者爱好[1]。辣椒酱正在坐褥存储历程中易展示染菌局面,从而导致产物酸败、变色、胀气等局面。辣椒酱中含有的细菌席卷乳杆菌属(Lactobacillus)和芽孢杆菌属(Bacillus),正在辣椒酱热炒制历程中能够杀死辣椒酱中的绝大一面微生物,但还是存正在一面芽孢杆菌属细菌通过造成芽孢的方法留正在辣椒酱中导致辣椒酱凋落[2]。

  古代微生物判断设施要紧通过形状张望、革兰氏染色及生化反映等法子,愚弄伯杰氏手册等原料举行比对剖释[3]。其操作简捷、结果直观,但存正在精度低、不实用于多量量的菌群剖释判断等弱点。跟着摩登生物手艺的发扬和测序手艺本钱的下降,摩登分子生物学手艺,如变形梯度凝胶电泳[4]、宏基因组测序[5]、扩增子测序[6]和16S rDNA测序[7]等法子,极大鞭策了微生物判断范围的发扬。16S rDNA存正在于全部细菌染色体内,编码16S rRNA对应DNA序列,具有品种少、含量高且高度顽固的性子。所以,采用细菌16S rDNA测序手艺对样品中的细菌举行编制判断的应器具有高通量、可完毕不行作育细菌的切确判断等一系列上风。

  辣椒酱的坐褥要紧能够分为3个工段,第一阶段是将鲜辣椒切碎后与食盐羼杂,并将羼杂物置于腌渍池内,应用轮回水喷淋的方法使食盐与辣椒充溢羼杂。将羼杂后的腌渍辣椒用食盐掩盖外层静置3个月后,正在第二阶段中将腌渍后辣椒与香料羼杂后于炒锅内于102 ℃炒制10~14 min,正在终末一阶段将炒制后辣椒酱注入冷却塔内,愚弄盘管冷却后举行包装。辣椒酱制品的盐度正在125~150 g/L,然而还是不妨爆发微生物污染事情。前期咨议涌现辣椒酱污染微生物要紧为细菌[2],然而污染微生物是怎么进入辣椒酱中的途径已经未知。本文针对某着名辣椒酱食物厂的工艺流程,正在辣椒酱原料栈房、炒制间和包装间3个工段分辩取样,并采用古代微生物作育设施联合16S rDNA测序对辣椒酱坐褥阶段修设和气氛中存正在的细菌情形举行剖释,分析辣椒酱分歧坐褥工段的要紧微生物,从而为辣椒酱品格把控和安乐坐褥供给按照。

  酵母粉、胰卵白胨:剖释纯,英邦OXOID公司;牛肉膏、K2HPO4、柠檬酸氢二胺、乙酸钠、葡萄糖、吐温80、MgSO4、MnSO4、琼脂粉:剖释纯,邦药集团化学试剂有限公司;细菌基因组DNA提取试剂盒,北京TIANGEN公司;琼脂糖、DNA Marker,上海Sangon Biotech公司;rTaq、引物,大连TaKaRa公司。

  细菌作育采用MRS和LB两种作育基。MRS作育基配方(g/L):卵白胨10、牛肉膏10、酵母粉5、K2HPO42、柠檬酸氢二胺2、乙酸钠5、葡萄糖2、吐温80 1、MgSO40.28 、MnSO40.14、琼脂粉15,pH自然,115 ℃湿热灭菌15 min;LB作育基配方(g/L):卵白胨10、酵母粉5、NaCl 10,pH自然,121 ℃湿热灭菌15 min。因为辣椒酱为高盐处境,所以正在MRS和LB作育基中需求插足与辣椒酱中相仿盐浓度的NaCl。

  ThermoStat plus金属浴,德邦eppendorf公司;主动控温气氛摇床,上海福玛实习修设有限公司; TGL-16G台式离心绪,上海安亭科学仪器厂;DYY-8C型电泳仪,北京市六一仪器厂;HVE-50全主动高压蒸汽灭菌锅,日本HIRAYAMA株式会社; MICROL17台式高速离心绪,美邦Thermo Fisher公司; GelDoc-ItTM凝胶成像编制,美邦UVP公司;TC5000 PCR仪,英邦TECHNE公司。

  本实习采用高盐MRS和LB琼脂作育皿,取样设施参考GB/T 18204.1—2000《稠人广众气氛微生物检讨设施-细菌总数测定》自然重降法。完全设施为:将作育皿置于坐褥车间及栈房的4角和焦点共5处,此中4角相距墙面1 m,间隔地面高度1 m。将作育皿掀开于气氛中揭露30 min, 采用无菌袋封装后分辩于37 ℃有氧和无氧处境中作育48 h。取样地方为:原料栈房、炒制间和包装间。

  修设取样应用无菌镊子,于各坐褥修设内壁刮取适量实质物于无菌三角瓶内。经无菌心理盐水稀释后涂布于高盐MRS和LB琼脂作育皿,分辩于37 ℃有氧和无氧处境下作育96 h。凭据稀释量与涂布量打算每克实质物内的细菌菌群数。

  以肉眼方法数出作育皿中的菌落数目。气氛菌群密度由奥梅梁斯基公式换算,并将单元转为CFU/m3。凭据该公式,正在100 cm2皮相积的作育皿上5 min内重降的菌群总数等同于10 L气氛内的菌群总数[8],完全公式如式(1)所示:

  式中:C,气氛内菌群总数,CFU/m3;N,作育皿内菌落数,CFU/皿;A,作育皿皮相积,cm2;t,作育皿与气氛接触时期,min。

  采用TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒提取样品总基因组DNA,完全操作设施参考察剂盒仿单。倾向产品于Nanodrop微量分光光度计检测浓度后于-20 ℃存在备用。

  将PCR产品委托上海生工生物工程有限公司测序。该公司测序采用Illumina手艺,该手艺为边合成边测序。正在测序时以单链DNA为模板,合成互补链时采用的dNTP带有荧光符号,分歧碱基荧光讯息经成像编制采撷整合后得出宗旨片断的碱基序列[9]。后续数据的解决设施如下:将reads中的接头序列和barcode序列滤掉;用flash软件将存正在overlap的reads对加以拼接;愚弄QIIME软件对付拼接的数据加以过滤,过滤掉含N较众或者含低质地碱基较众的序列;过滤掉拼接序列内的嵌合体序列[10]。终末将拼接后的结果与美邦邦立生物手艺讯息中央(NCBI Blast)举行比对。取最宛如结果,判断出该序列所对应的菌株[11]。

  将取样所得单菌落用接种环挑至安插了杜氏小管的厌氧管内,以高盐MRS和LB作育基分辩于37 ℃下好氧或厌氧作育96 h,张望产气情形,完全设施参考文献[12]。

  本咨议采用MRS和LB两种作育基对厌氧菌修好氧菌举行作育,由来基于本实习室先前针对统一食物厂中豆瓣酱菌群剖释的咨议,涌现正在改进TJA作育基、MRS作育基、M17作育基、养分肉汤作育基、LB作育基和RCM作育基中,LB作育基针对好氧菌,MRS作育基针对厌氧菌有较好的散开结果[13]。

  针对辣椒酱坐褥历程气氛中的细菌菌群情形,本咨议对原料栈房、炒制间和包装间的气氛举行了取样并对其微生物总数举行计数。如图1所示,辣椒酱原料栈房、炒制间和包装间气氛中的好氧菌菌群密度分辩为3.0×102、1.3×104、8.2×102CFU/m3,而厌氧菌菌群密度分辩为1.4×103、3.4×103、7.0×101CFU/m3。

  气氛内的菌群数受到地方、温度、湿度等稠密身分影响,平凡而言室内菌群数较室外高[14]。本咨议中,气氛中好氧菌浓度除原料栈房外,均高于厌氧菌菌浓度。凭据现实情形,料想辣椒酱坐褥历程中好氧菌要紧源自气氛贯通等各式方法,厌氧菌的要紧来历为辣椒酱。原料栈房中厌氧菌菌浓高源自于该工段的坐褥形式,盐渍辣椒采用50 kg塑料包装由供应商处运至原料栈房,通过人工卸货方法注入暂储池,全程为怒放式操作,正在注入时厌氧菌由此进入气氛。包装间厌氧菌、好氧菌菌群数低则是因为包装线的密封性,且各闭头均采用了席卷紫外照耀,按期消毒等方法举行消鸩杀菌,所以厌氧菌浓度很低。炒制间细菌菌浓明显增高,由来正在于该坐褥工序采用炒锅对辣椒酱举行炒制,炒制历程中发作高温、高湿,其室内均匀温度可达42.1 ℃,远高于其他工段(21.3 ℃);相对湿度可达98%,远高于原料栈房(65%)和包装间(61%),且墙壁有肉眼可睹的冷凝水析出,所以该高温、高湿处境有利于细菌大方增殖。与此同时,该处境长远用于坐褥辣椒酱,可视为一种采取性作育基,对付特定细菌具有富集效用。

  本文进一步对辣椒酱3个坐褥工段修设上的细菌菌群举行取样和剖释。由图2可知,原料栈房、炒制间和包装间修设中的好氧细菌菌群密度分辩为1.4×105、7.6×105、3.6×107CFU/g,而厌氧细菌菌群密度分辩为2.1×105、8.7×105、7.4×107CFU/g。包装间与原料车间修设中厌氧菌含量明显高于好氧菌,其由来正在于:炒制时搅拌浆带入大方气氛,使得辣椒酱内溶氧量上升,而溶氧量的上升会导致后续包装段好氧菌的大方增殖,而原料和包装工段均处于厌氧处境,所以厌氧菌数目高于好氧菌。另外,辣椒酱冷却时正在一段较长时期内会撑持正在30~60 ℃,会促使芽孢杆菌芽孢萌发,从而使包装线内厌氧菌的大方增殖[15]。此注解与包装线内厌氧菌中芽孢菌含量高的局面相符。外皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)和众粘芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)2种芽孢杆菌即占总菌群比重64.54%。综上,对付微生物的左右核心正在于炒制后到灌装这一阶段,此阶段内微生物大方增殖,使其菌种的数目和品种均有大幅度晋升。

  为了进一步剖释辣椒酱坐褥历程中微生物的构成情形,本咨议进一步愚弄16S rDNA测序手艺对辣椒酱3个坐褥阶段气氛和修设中的细菌构成举行了剖释。如图3所示,本咨议从辣椒酱坐褥工段气氛中共检出6种好氧菌和16种厌氧菌。正在好氧菌中,3种为芽孢杆菌,1种为葡萄球菌,2种为考克氏菌。庞杂芽孢杆菌(B.megaterium)和短小芽孢杆菌(B.pumilus)正在3个工段均有检出,而枯草芽孢杆菌(B.subtilis)仅正在原料栈房内检出;2株考克氏菌(Kocuriasedimini,K.palastris)存正在于原料栈房和炒制间,而人类葡萄球菌(S.hominis)正在包装栈房及包装间检出。正在该6种好氧菌中,除考克氏菌外其余5种均可产芽孢[16]。3个工段的好氧菌中芽孢菌占比分辩为52.31%、80.23%、100%,这注明正在辣椒酱坐褥历程中芽孢菌具有相对较强的人命力。与此同时,本咨议从辣椒酱坐褥工段气氛中筛选获得16种厌氧菌。从图3-B能够看出,维氏链球菌(Straphylococcuswarneri)、头链球菌(S.capitis)、人类链球菌(S.hominis)、木糖溶纤维素梭菌(C.xylanolyticum)和众粘芽孢杆菌(P.polymyxa)正在辣椒酱全部坐褥工段均能检出。正在原料阶段检出的7种细菌菌株即使此中一面菌株正在炒制工段未检出,但正在包装线均有检出,此中产芽孢菌占比57%。原料辣椒始末炒制后,木糖溶纤维素梭菌(C.xylanolyticum)和德氏肠球菌(Enterococcusdevriesei)所占比例分辩消重89.3%、72%,而外皮葡萄球菌(S.epidermidi)和暗沟肠杆菌(Enterobactercloacae)所占比例,上升113%、95%。正在炒制辣椒中共新检出2种菌:催产克雷伯氏杆菌(Klebsiellaoxytoca)和维氏肠球菌(E.vikkiensis)。3个工段的厌氧菌中芽孢菌占比分辩为28.69%、80.23%、65.00%。辣椒酱各阶段样品细菌菌群中芽孢杆菌比例高,始末加热后芽孢杆菌比重昭彰上升,解释炒制灭菌能够杀灭细菌养分体而对芽孢结果较差。灭菌后非产芽孢菌的节减减轻了对产芽孢菌的逐鹿克制,从而有利于产芽孢菌的滋长[17]。

  正在散开到的厌氧菌中,头葡萄球菌(S.capitis)[18]、暗沟肠杆菌(E.cloacae)[19]、克雷伯氏杆菌(K.oxytoca)[20]、维氏肠球菌(E.vikkiensis)[21]、轻型链球菌(Streptococcusmitis)[22]均为条款致病菌。此中头葡萄球菌(S.capitis),暗沟肠杆菌(E.cloacae)和轻型链球菌(S.mitis)为革兰氏阳性菌,能够思虑正在炒制后插足乳酸链球菌素(nisin)举行特异性克制。乳酸链球菌素会导致革兰氏阳性菌细胞膜粉碎,导致ATP等物质外泄并导致细胞熔解,同时对付孢子也有优越杀灭效用[23]。

  本咨议通过16S rDNA手艺对付修设内散开到的好氧菌和厌氧菌举行了判断。如图4-A所示,本工段共检出好氧菌3种,分辩为短小芽孢杆菌(B.pumilus)、庞杂芽孢杆菌(B.megaterium)、地衣芽孢杆菌(B.subtilis),此中地衣芽胞杆菌为兼性厌氧菌,所以正在好氧和厌氧处境下均有检出。如图4-B所示。共检出6种厌氧菌,此中芽孢菌2种,为木质纤维素梭菌(Clostridiumxylanolyticum)和众黏芽孢杆菌(P.polymyxa),其余为非芽孢菌。此中木质纤维素梭菌(C.xylanolyticum)、克雷伯氏菌(K.oxytoca)和众黏芽孢杆菌(P.polymyxa)正在全部工段均有检出。辣椒原料始末炒制后,众黏芽孢杆菌(P.polymyxa)从占比13%弥补至65%,并正在制品中不停撑持较高水准(57%);木质纤维素梭菌(C.xylanolyticum)由发端的32%消重至11%。值得预防的是,正在6种厌氧菌中,存正在维氏肠球菌(E.vikkiensis)、德氏肠球菌(E.devriesei)、暗沟肠杆菌(E.cloacae)、克雷伯氏菌(k.oxytoca)4种条款致病菌,而众粘芽孢杆菌(P.polymyxa)能够产细菌素,对付细菌和线 分歧工段修设中好氧菌群(A)、厌氧菌群(B)构成Fig.4 The aerobic bacteria (A) and anaerobe (B) in the

  将各工段取样得回的单菌落于安插了杜氏小管的高盐MRS液体作育基内举行纯作育96 h,凭据杜氏小管内气体敷裕情形占定各厌氧菌的产气材干。产气菌及其产气材干睹外1所示。外1各工段修设内厌氧菌产气情形

  andtheirgasproductionineachsection注:“-”未检生产气菌;“+”显露气体亲昵或到达杜氏小管的1/3;“++”显露气体亲昵或到达杜氏小管的2/3。正在气氛中共检出2株厌氧产气菌,分辩为木糖溶纤维素梭菌(

  tabaci)。原料栈房内2者均有所检出,占比分辩为1.12%和0.45%;包装线检出木糖溶纤维素梭菌(C.xylanolyticum),占比1.07%。始末96 h的厌氧作育,木糖溶纤维素梭菌产气1/3杜氏小管,烟草杆菌(E.tabaci)产气2/3杜氏小管。修设中共检出4株产气菌,分辩为暗沟肠杆菌(E.cloacae),维氏肠球菌(E.vikkiensis),德氏肠球菌(E.devriesei),枯草芽胞杆菌(B.subtill)。正在包装修设总菌群平分辩占比:10%、6.7%、7.1%、12.3%。厌氧菌产活气体为葡萄糖经糖酵解途径发作CO2[25]。3 结论本文愚弄16S rDNA测序法,联合古代的作育皿作育法,对辣椒酱坐褥3个工段的修设和气氛中的细菌菌群举行了散开,对其布局举行了判断。宗旨正在于细致懂得各工段的上风菌群,从而指挥现实坐褥举行生物学防治,节减染菌概率。从判断结果来看,气氛内检出6种好氧菌,此中芽孢菌3种;16种厌氧菌,此中芽孢菌13种。气氛中产气菌3种;修设内检出好氧菌3种,均为芽孢菌;厌氧菌6种,此中芽孢菌2种。修设内产气菌4种。与此同时,还声懂得正在包装线菌群数目有大幅晋升,存正在二次染菌的不妨。所以应针对以上特性,增强灭菌密度和强度。鉴于散开到的细菌中革兰氏阳性菌占比力高,能够思虑正在后期插足nisin举行生物学防制,从而进步抑菌结果。返回搜狐,查看更众

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